Вестник МГТУ, 2025, Т. 28, № 2.

Валиева Ш. С. и др. Создание устойчивой к протеолизу пептидной последовательности. Введение Одним из представителей суперсемейства белков TGF-P является белок GDF-11, известный как фактор роста и дифференцировки - костный морфогенетический белок (BMP-11). Этот белок был открыт в 1999 г. Накасимой и др. (Nakashima et al., 1999). В исследованиях, проведенных Макферроном и др. (McPherron et al., 1999), установлен ген, кодирующий белок. Открытый ген находится в 12 хромосоме (12q13.2). Структура белка GDF-11 включает 136 аминокислот в мономерной форме (Poggioli et al., 2016). В результате гидролиза молекулы предшественника белка фурином (Suh et al., 2020) образуется зрелая форма белка с нековалентными N-концевыми про- и С-концевыми доменами. За счет дисульфидных и межцепочных мостиков белок GDF-11 является гомодимером с молекулярной массой 32,6 кДа и третичной структурой, которая включает p-лист, цистеиновый узел и а-спираль (Pepinsky et al., 2017; Padyana et al., 2016). Экспрессируется GDF-11 во многих органах и тканях, в частности, в головном и спинном мозге, кишечнике, селезенке, сердце, крови, скелетной мускулатуре и др. Уровень экспрессии различается в зависимости от типа и происхождения клеток (Jamaiyar et al., 2017). Анализ, проведенный Коузом и др. (Cox et al., 2019), показал высокую экспрессию GDF-11 в костях черепа эмбрионов мышей. Согласно данным, представленным на платформе PeptideAtlas1, высокая экспрессия белка отмечена у взрослого человека в коре головного мозга, надпочечниках и мягких тканях. Впервые роль GDF-11 как фактора передачи сигналов в клетке при воспалительном процессе, его значение в регенерации и омоложении организма отметили в 1999 г. (Moses et al., 2016). Вместе с тем механизм действия GDF-11 при воспалении в ответной реакции организма на инфекционный процесс, действие токсинов и факторов, повреждающих клетки, полностью не раскрыт. Однако известно, что GDF-11 ослабляет образование воспалительной микросреды путем регуляции высвобождения интерлейкинов, в частности, IL-6, IL-1P, а также снижения накопления активных форм кислорода - H2O2, NO (Janakiram et al., 2014; Chen et al., 2018). В эксперименте на лабораторных животных (Wang et al., 2018) установлено, что введение белка в дозе 0,6 мг/кг каждые 2 дня в брюшную полость мышей с экспериментальным колитом снижало потерю веса и клинические симптомы. На гистопрепаратах толстой кишки показано, что GDF-11 ослабляет гистопатологические изменения, в частности, разрушение крипт, потерю бокаловидных клеток, инфильтрацию моноцитов, повреждение слизистой оболочки и некроз, как в контрольной группе мышей без инъекции GDF-11. Следует отметить, что актуальным остается проблема перорального применения многих белков и пептидов, в том числе белка GDF-11, в качестве лекарственных препаратов и в составе продуктов специализированного и функционального назначения, так как вещества белковой природы, поступая в желудочно-кишечный тракт (ЖКТ), подвергаются протеолитическому гидролизу и их биологическая активность снижается или полностью теряется (Wang et al., 2022). Повысить устойчивость белков к протеолизу и, соответственно, обеспечить необходимую биодоступность возможно за счет сшивок структуры белка, а именно путем образования дисульфидных мостиков или увеличения их количества (Qin et al., 2023). Целью исследований является разработка устойчивой к протеолизу пептидной последовательности белка GDF-11 с виртуальным скринингом ее токсичности, аллергенности, уникальности с последующим синтезом соответствующей плазмиды для экспрессии белка в E. coli. Материалы и методы В качестве объектов исследования использовали белок GDF-11, плазмиды pET-25b(+) для экспрессии в E. coli с пептидной последовательностью CTVDСFFEСAFGСWDС. Антигенность (аллергенность) пептида оценивали по программе2. Виртуальный скрининг токсичности сшитой пептидной последовательности проводили с помощью платформы Admet ab 33. Уникальность пептидной последовательности определяли на платформе PeptideAtlas4. Из олигонуклеотидов методом циклической сборки провели синтез гена белка GDF-11 с последовательностью СTVDСFFEСAFGСWDС. Предварительно были синтезированы комплементарные цепи гена олигонуклеотиды, перекрывающиеся участками от 20-30 пар оснований. Для заполнения промежутков между олигонуклеотидами были достроены цепи с использованием ДНК-полимеразы. На последнем этапе сконструированный ген амплифицировался путем стандартной ПЦР. Полученную последовательность плазмиды, кодирующую новый белок GDF-11, обработали эндонуклеазами рестрикции 1https://db.systemsbiology.net/sbeams/cgi/PeptideAtlas/Search. 2http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl ; ToxinPred (http://crdd.osdd.net/raghava/toxinpred/. 3https://admetlab3.scbdd.com/documentation/#/. 4https://db.systemsbiology.net/sbeams/cgi/PeptideAtlas/Search. 144