Вестник МГТУ, 2023, Т. 26, № 3.

Вестник МГТУ. 2023. Т. 26, № 3. С. 232-241. DOI: https://doi.org/10.21443/1560-9278-2023-26-3-232-241 Введение Пищевые антимикробные пептиды (АМП) становятся более актуальными при лечении бактериальных инфекций и имеют ряд преимуществ в сравнении с лекарственными средствами: медленное возникновение резистентности у штаммов бактерий, высокая активность в отношении антибиотикопленки и иммуномодулирующие свойства. Поскольку ЛИП имеют белковую природу, их можно относительно легко спроектировать и синтезировать. В качестве недостатка использования АМП следует отметить низкую стабильность к действию протеолитических ферментов желудочно-кишечного тракта (Magana et al., 2020). Антимикробная активность пептидов связана с физико-химическими свойствами, в частности, катионным зарядом и гидрофобностью (Lee et al., 2018). Положительный заряд улучшает взаимодействие с отрицательно заряженной поверхностью клетки, а высокая гидрофобность позволяет пептидам проходить сквозь мембраны бактериальных клеток. Важным фактором, влияющим на антимикробную активность пептидов, является аминокислотная последовательность (Porto et al., 2018). Целесообразно кратко рассмотреть механизм действия АМП, который по данным (Silva et al., 2017) заключается в следующем: - разрушение бактериальной мембраны с образованием пор или с помощью электропорации; - взаимодействие с бактериальными компонентами и индукция гибели клеток; - ингибирование биосинтеза клеточной стенки. Следует отметить, что АМП эффективно действуют в комбинации с другими лекарственными средствами (Magana et al., 2020; Gaglione et al., 2020; Mehta et al., 2022). Для прогнозирования биологической активности пептидов, в том числе АМП, применяют биоинформационный подход, основанный на использовании протеомных баз данных, в частности, PeptideCutter, Protein NCBI, BIOPEP, AVPdb и других. В качестве источника АМП используется ферментированный пепсином или трипсином соевый белок (Соколов и др., 2023), белок мяса и мясопродуктов (Chernukha et al., 2020), белок яичного альбумина (Жамсаранова и др., 2021), ферменты бактериофагов (Peng et al., 2017). Одним из перспективных источников АМП являются молочные белки, в частности, белки молозива коров (Flom et al., 2019; Yang et al., 2019). Следует отметить, что нативные молочные белки - казеин (CN), в-лактоглобулин (BLG) и а-лактальбумин (ALA) - могут вызывать пищевую аллергию (Hattori et al., 2004). После ферментативного гидролиза молочного белка полученные пептиды, как правило, не содержат эпитопы аллергенов (Picariello et al., 2013). Важным фактором, обусловливающим использования молозива коров в качестве источника АМП, является то, что оно содержит пептиды и белки с прямым противомикробным действием (Stelwagen et al., 2009). Целью работы является выделение из пепсинового гидролизата молозива коров пептида, прогнозирование его антимикробной активности с использованием биоинформационного подхода и подтверждение его эффективности in vitro. Материал и методы Для выделения пептида использовали молозиво коров черно-пестрой породы, отобранное через 4 часа после отела (агрокомплекс Аверино, Свердловская область). В качестве белка-предшественника использовали лактоферрин. Гидролиз белков молозива проводили по следующим параметрам: продолжительность - 4,5 ч, количество фермента (пепсин, КФ 3.4.23.1, активность 1 200 ЕД (Сигма, Германия)) - 3,6 %, pH = 1,6; t = 39 °C. Математическое моделирование процесса гидролиза белков молозива и прогнозирование биологической активности полученных пептидов проводили с помощью программы Microsoft Excel 2021 с учетом авторской программы исследователей (Агаркова и др., 2023) и с использованием баз данных белков APD, BIOPEP, Protein NCBI, PeptideCutter, противовирусных пептидов CSIR и других. Для исследования пептидного состава ферментативного гидролизата молозива коров удаляли осадок центрифугированием при 3 900 об/мин в течение 5 мин и работали с надосадочной жидкостью и осадком. Надосадочную жидкость разделяли методом препаративной хроматографии на силикагеле 60 PF 254, элюэнт PBS и EtOH в изократическом соотношении 9 : 1. Далее изучение белкового состава надосадочной жидкости ферментативного гидролизата молозива проводили осаждением белков сульфатом аммония. После осаждения образцы центрифугировали (3 900 об/мин в течение 5 мин) и собирали белковый осадок. Белковый осадок гидролизата, полученный при центрифугировании гидролизата молозива, и осадок надосадочной жидкости очищали от солей и неорганических примесей на колонке с Amberlit XAD2, элюэент: Буфер А: 10 mM CH3COONa pH = 6; 10 mM CH3COONa pH = 4; 10 mM KCl/HCl pH = 1,5 с градиентом соли буфер А + 0,2 %, 0,4 %, 1 % NaCl. Фракции каждого образца изучали на наличие белка методом Брэдфорда. Полученные фракции пептидов из раствора образцов были разделены методом препаративной хроматографии на силикагеле, элюэнт PBS и EtOH в изократическом соотношении 9 : 1 соответственно. 233