Вестник МГТУ, 2023, Т. 26, № 1.

Петров А. Н. и др. Экспериментальная оценка токсикорезистентности бентосной микроводоросли. Материалы и методы В токсикологических экспериментах использована клоновая культура бентосной диатомовой водоросли Thalassiosira excentrica, выращенная путем изолирования одиночной клетки под бинокуляром МБС-10 (Россия, ЛЗОС) при увеличении *40 с последующей семикратной промывкой культуральной средой (Гайсина и др., 2008; Романова и др., 2017; Петров и др., 2020). Клоновая линия выделена из состава микрофитобентоса рыхлого субстрата, отобранного в бухте Ласпи (юго-западная часть Крыма, 44°25'10"N, 33°42'27"E) на глубине 9 м. Вид морской, бенто-планктонный, встречается часто в прибрежных районах; образует колонии по 4-8 клеток, соединенных тонкими прозрачными тяжами. Створки дисковидные, диаметром около 40 дм. Структура створки состоит из округло-полигональных ареол, расположенных в тангентальных рядах, 8-9 в 10 дм (рис. 1). Размеры клеток указаны на момент начала культивирования. Рис. 1. Морская диатомовая T. excentrica, использованная в эксперименте: 1 - колония живых клеток (СМ х10); 2 - живая клетка (СМ *60, масштаб 10 дм); 3 - створка, вид снаружи (СЭМ *2 000) Fig. 1. Marine diatom T. excentrica used in the experiment: 1 - alive colony (LM *10); 2 - alive cell (LM *60, scale bar 10 дщ ); 3 - valve external view (SEM *2 000) Клоновую линию содержали на питательной среде Гольдберг, модифицированной для оптимального культивирования морских бентосных диатомовых, при естественном освещении и постоянной температуре 22 ± 2 °С. Морскую воду для приготовления среды отбирали в 12-мильной зоне у побережья Крыма, фильтровали через фильтр 0,45 мкм, затем трижды пастеризовали при температуре 75 °С и вносили питательные вещества в соответствии с протоколом (Петров и др., 2020). В ходе культивирования и эксперимента фотографии живых и мертвых клеток получали под инвертированным световым микроскопом (СМ) Nicon Eclipse с объективом Plan Fluor *60 OFN25 и камерой Infinity3-6URC (Nicon Corp., Япония). Идентификацию очищенных створок проводили под СМ Carl Zeiss Primostar Plus c объективом Plan- Achroplan *100, а также под сканирующим электронным микроскопом (СЭМ) Hitachi SU3500 (Япония). В каждую чашку Петри диаметром 90 мм вносили последовательно по схеме определенное количество питательной среды, стокового раствора CuSO4 5H2O и 1 мл инокулята клоновой культуры T. excentrica, чтобы общий объем жидкости составил 30 мл. Протокол эксперимента подробно описан ранее (Неврова и др., 2022). В ходе эксперимента проводили тестирование T. excentrica на воздействие возрастающих концентраций токсиканта: 32, 64, 128, 256, 320, 512 и 1 024 мкгл -1 (в пересчете на ионы меди) по сравнению с контролем (питательная среда Гольдберг без добавления токсиканта). Чашки Петри герметизировали пленкой Parafilm®, чтобы исключить контаминацию и испарение экспериментального раствора. Продолжительность экспериментов составляла 10 суток, периоды экспозиции - 1, 3, 5, 7 и 10 суток. Данные временные периоды выбраны с целью возможности оценить хронический аспект токсичности сульфата меди, а также детально рассмотреть динамику отклика клоновой культуры T. excentrica на воздействие различных концентраций токсиканта. Каждый вариант концентрации ионов меди исследовали в 3-кратной повторности, включая контроль. Реакцию клоновой линии на воздействие разных концентраций Cu2+ определяли визуально по микрофотографиям на основе подсчета доли живых клеток (%). Контроль прижизненного состояния оценивали по форме и целостности панциря, неизменности структуры и цвета хлоропластов, разделению клеток после вегетативного деления; в случае же лизиса клеточного содержимого, резкого потемнения хлоропластов, раскрытия панциря - клетку определяли как мертвую (рис. 2). Численность живых и мертвых клеток в каждый период экспозиции определяли по усредненным данным, полученным при фотографировании 10-15 случайных полей зрения. 80