Вестник МГТУ, 2021, Т. 24, № 3.

Кучина Ю. А. и др. Химическая и ферментативная деструкция хондроитина сульфата. азота определяли методом Кьельдаля; минеральные вещества определяли методом сжигания в муфельной печи при 550 ± 10 °С. Содержание ХС в образцах определяли методом Дише, который основан на цветной реакции уроновых кислот с карбазолом (Dische, 1947; Jo et al., 2005). Рентгенофазовый анализ образцов хондроитина сульфатов проводили на дифрактометре LabXXRD-6000 (Shimadzu Corp., Япония). Излучение рентгеновской трубки - Cu-Ка, использовался графитовый монохроматор, X - длина волны монохроматического рентгеновского излучения 1.54178 А. Получали дифрактограммы, с помощью которых определяли степень кристалличности. Степень кристалличности (%кр) определяли по отношению интегральной интенсивности сигнала кристаллических областей на дифрактограмме к общему интегральному сигналу (Новиков и др., 2012). Для вычисления сигнала, обусловленного наличием кристаллических областей в образцах, графически определили общую площадь под кривой дифракционной картины S ^ и площадь аморфной составляющей SaM^. Площади на дифрактограмме, соответствующие аморфной и кристаллической фазам, определяли с помощью компьютерной программы lpSquare. Степень кристалличности %кр(%) рассчитывали по формуле S - S общ аморф Хкр = ------ S-------- ХІ00, кр где S ^ - общая площадь под кривой дифракционной картины в диапазоне 2Ѳ от 6 до 36°; S^pj, - площадь аморфной составляющей дифракционной картины; S ^ - площадь кристаллической составляющей дифракционной картины. Среднемассовую молекулярную массу хондроитина сульфата определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (Новиков и др., 2012) и нефелометрическим методом (Mathews et al., 1958). При определении ММ методом ВЭЖХ регистрацию пиков выполняли на хромато-масс-спектрометре LCMS-QP8000 (Shimadzu, Япония) со спектрофотометрическим детектором (модель SPD - 10 AVVP) при X = 205 нм. Хроматографическое разделение проводили на колонке Tosoh TSKgel Alpha-4000 при 25 °С в изократическом режиме, скорость потока 0,8 мл/мин, элюент - водный раствор NaCl с концентрацией 0,15 моль/л, объем пробы 10 мкл. Для калибровки колонки использовали образцы с известной молекулярной массой, коэффициент корреляции составил 0,98. Растворимость образцов ХС определяли при различных значениях рН. ХС смешивали с растворителем в массовом соотношении 1 : 100 и оставляли для набухания при постоянном перемешивании в течение 2 часов. Затем растворы выдерживали при температуре 20-25 °С в течение 22 часов. Не растворившуюся часть отфильтровывали с помощью фильтра Шотта, взвешенного до постоянной массы. Растворимость оценивали в процентах от исходной массы образца. Результаты и обсуждение Идентификацию полученных образцов хондритина сульфата проводили методом ИК-спектроскопии (рис. 2). В качестве образцов сравнения (рис. 2, кривые 1, 2) использовали стандартные препараты хондроитина сульфата фирмы Sigma-Aldrich. По литературным данным хондроитина сульфат, полученный из морских гидробионтов, должен иметь полосы поглощения на волновых числах 1 550, 1 350-1 300 и 1 160-1 120 см-1 (Garnjanagoonchorn et al., 2007). На рис. 2 (кривая 3) приведен спектр образцов ХС, полученных с использованием на стадии ферментолиза фермента протосубтилин. Для образцов ХС, полученных с использованием панкреатина и гепатопанкреатина, ИК-спектры были аналогичны. Для сравнения на рис. 2 (кривые 1, 2) приведены спектры хондроитина сульфата из морских гидробионтов, Европейский Фармстандарт (Sigma) - кривая 1 и хондроитина сульфата из хрящей акулы, Американский стандарт (Sigma) - кривая 2. Анализ ИК-спектров показал, что полученные образцы хондроитина сульфата имеют пики поглощения на характерных для данного полисахарида волновых числах. Наличие пиков на этих волновых числах свидетельствует о том, что спектры полученных препаратов соответствуют спектрам хондроитина сульфата. Из литературных данных известно, что об источнике получения ХС можно судить по специфическим полосам поглощения (Garnjanagoonchorn et al., 2007). Поглощение на волновом числе 850 см-1 (хондроитин- 4-сульфат) свидетельствует о том, что ХС получен из ткани млекопитающих. Поглощение в диапазоне волновых чисел 825-820 см-1 (хондроитин-6-сульфат) характерно для хондроитина сульфатов из хрящевой ткани рыб. 270