Вестник МГТУ, 2021, Т. 24, № 3.

Кольберг Н. А. и др. Оценка влияния ферментативного гидролизата фабрициевой сумки. желтую растворимую соль МТТ (3-(4,5-диметитиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид) до синего нерастворимого формазана, который накапливается в цитоплазме клеток. Реакция происходит только в живых клетках с активными митохондриальными ферментами. Таким образом, количество окрашенных клеток и степень фиалетово-синего окрашивания их цитоплазмы коррелирует с общей жизнеспособностью клеточного монослоя. Ферментативный гидролизат в различных концентрациях добавляли к кондиционированным клеткам и инкубировали в течение 48 часов. После окончания периода инкубации с тестируемым препаратом в лунки добавляли раствор MTT до конечной концентрации 500 мкг/мл и инкубировали еще 4 часа в стандартных условиях. Затем аккуратно убирали питательную среду и растворяли клеточный монослой в 10%-м растворе додецилсульфата натрия в 0,01 М соляной кислоте. После полного растворения клеток измеряли оптическую плотность растворов при длине волны 595 на многоканальном спектрофотометре ("Пикон", Россия). Оптическая плотность раствора в контрольных лунках, содержащих клетки без добавления ферментативного гидролизата, принималась за 100 %. Процент жизнеспособных клеток в лунках с ферментативным гидролизатом рассчитывался как отношение их оптической плотности к оптической плотности контрольных лунок без ферментативного гидролизата, умноженной на 100. В каждом отдельном эксперименте все пробы готовили в триплетах. По изменению оптической плотности в лунках с клетками, содержащих ферментативный гидролизат, делали вывод о цитотоксической активности БАД. Исследуемый ферментативный гидролизат добавляли к клеткам-мишеням в концентрации от 10 мг/мл до 0,02 мг/мл. Разведение исходного образца ферментативного гидролизата готовили на питательной среде для культивирования клеток. Период инкубации препарата с клетками составлял 48 часов. По истечении этого периода производили оценку жизнеспособности клеток, подвергавшихся действию препарата. Для эксперимента по определению влияния ферментативного гидролизата на неспецифическую резистентность к инфекциям сформировали три равные экспериментальные группы белых беспородных мышей (самцы/самки, 20 ± 2 г). Всем лабораторным животным скармливали ежедневно в течение семи суток ферментативный гидролизат в дозе 750 мг/кг (терапевтическая доза), 150 мг/кг (0,2 терапевтической дозы) и 3 750 мг/кг (пять терапевтических доз). Одновременно контрольная группа животных получала внутрижелудочно воду в том же объеме. Через 24 часа после последнего приема ферментативного гидролизата животных внутрибрюшинно заражали различными дозами (5, 50, 500, 5 000 КОЕ) суточной агаровой культуры Salmonella enteritidis 92. В те же сроки культуру вводили контрольным (интактным) мышам. Каждая экспериментальная и контрольная группа животных состояла из 6 мышей обоего пола. Наблюдение за животными длилось в течение 21 суток после заражения. Защитное действие испытуемого ферментативного гидролизата определяли двумя биологическими способами: по выживаемости мышей из различных экспериментальных групп и показателю ЛД 50 . Кроме того, определяли эффективную терапевтическую дозу, отмечая выживаемость мышей, получавших различные дозы ферментативного гидролизата и инфицированных 700 ЛД 50 штамма S. enteritidis 92. Средняя летальная доза (ЛД50) данного штамма для мышей - 7 микробных клеток (м.к.) при внутрибрюшинном заражении. У всех павших мышей проводился бактериологический анализ селезенки на наличие специфического возбудителя. Результаты и обсуждение Разработана технология производства ферментативного гидролизата фабрициевой сумки цыплят- бройлеров, состоящая из промывки проточной водой сырья, куттерования, гомогенизации, ферментирования, ультрафильтрации и упаковки. Для производства ферментативного гидролизата отбирают фабрициевую сумку после убоя цыплят- бройлеров в возрасте 35 дней. Затем сырье помещают в емкость и промывают проточной водой в течение 10 минут при температуре воды 16-18 °С. Следующим этапом производства является куттерование сырья в течение 3 минут при частоте вращения ножей 2 400 об/мин с последующей гомогенизацией. Сырье загружают в емкость гомогенизатора, оборудованного рубашкой, наполненной дистиллированной водой и имеющей встроенный нагревательный элемент, гомогенизируют при скорости вращения насадки L5M компании "Сильверсон" (МВ) 6 000 об/мин при температуре 4 °С. Указанную температуру задавали с помощью насоса и компрессора холодильной установки, имеющихся в гомогенизаторе. Затем полученную массу нагревали до температуры оптимума активности фермента папаина (40°) и вносили фермент (Papain, КФ 3.4.22.2), растворенный в фосфатно-буферном растворе с рН 6,0 из расчета 0,15 % к основному сырью (фабрициева сумка), выдерживали в течение 8 часов. Затем ферментированное сырье пропускали через ультрафильтрационную лабораторную установку с размером пор 10 кДа. Ультрафильтрацию сырья проводили при следующих технологических параметрах: u > 1,5 м/с; Р = 0,3 МПа; t = 20 ± 5 °С. В табл. 2 представлены сводные данные трех экспериментов о жизнеспособности всех используемых клеточных линий после их обработки ферментативным гидролизатом фабрициевой сумки цыплят-бройлеров. 262