Вестник МГТУ. 2020, Т. 23, № 3.

Юрова Е. А. и др. Применение молекулярно-генетических методов анализа. разработкой методик измерений, базирующихся на принципах ПЦР диагностики, но с учетом всех достоинств и недостатков метода. В настоящее время методы ПЦР диагностики уже успешно применяются для определения видового состава мясной и рыбной продукции, а также пивоваренной продукции (Lockey et al., 2000; Oganesyants et al., 2019). Целью данной статьи является обобщение анализа литературных данных, нормативно­ методических документов по оценке методических подходов по применению метода ПЦР диагностики для идентификации пищевой продукции и разработки способов использования количественной конкурентной ПЦР и ПЦР в реальном времени (real time PCR) для контроля состава молочной продукции, в том числе и видового. Материалы и методы Объектами исследований являлись образцы молока коровьего, козьего, овечьего, а также смешанные в различных соотношениях образцы молока разных видов животных. При подготовке проб к измерению учитывали содержание массовой доли жира. Для экстракции ДНК из образцов молока использовали принципы и подходы, описанные в литературе (Ахметов и др., 2009; Бигаева и др., 2019а): 10 г исследуемого образца подвергали центрифугированию при 5 000 об/мин при температуре 4 °С. Далее верхний надосадочный слой удаляли. Осадок дважды промывали объемом 500 мкл PBS (pH 7,4) и дважды осуществляли промывку дистиллированной водой объемом 500 мкл. Далее еще раз центрифугировали в центрифужной пробирке вместимостью 1,5 мл в течение 10 мин при 10 000 об/мин при 4 °C. К осадку для экстрагирования добавляли 350 мкл буфера (рН 8,0, 100 мМ Трис Cl, 100 мМ NaCl и 5 мМ ЭДТА), 50 мкл 20%-го раствора SDS и 10 мкл протеиназы К (20 мг/мл). Эту смесь затем инкубировали при 55 °С в течение 4 ч. После чего добавляли равный объем трис-фенола, смесь перемешивали на вортексе в течение 1 мин и центрифугировали 10 мин при 10 000 об/мин и 4 °C. Полученный супернатант экстрагировали смесью фенол : хлороформ : изоамиловый спирт в соотношении 24 : 25 : 1 и дважды с равным объемом смеси хлороформ : изоамиловый спирт в соотношении 25 : 1. Далее проводили процедуру осаждения ДНК ледяным абсолютным этанолом и впоследствии проводили промывку смесью этанол : вода (7 : 3). Полученную ДНК растворяли в 25 мкл трис-ЭДТА до значения рН, равным 8,0. Концентрацию и чистоту выделенной ДНК контролировали по поглощению при длине волны 260 и 280 нм с использованием сканирующего спектрофотометра Biowave II (Великобритания). Целостность ДНК оценивали посредством электрофореза в 1%-м агарозном геле в электрофорезной горизонтальной камере Mini-Sub Cell GT System производства фирмы Bio-Rad (США) в течение 40 мин при 100 V. Оценка геля проводилась при ультрафиолетовом излучении посредством гель- документирования на оборудовании EC3 Imaging System. Результаты и обсуждение На начальной стадии подготовки к выполнению работы провели анализ литературных источников и государственных стандартов, который позволил определить возможность использования метода ПЦР диагностики для целей идентификации пищевой продукции. В результате было отмечено, что стандартизованных методик измерений с применением метода ПЦР анализа недостаточно. Кроме того, все эти методы, представленные в табл. 1, рассчитаны преимущественно на определение ГМО, ГМИ и новых линий ГМО 2-го поколения. При этом одной из представленных методик в сельскохозяйственной продукции можно определить видовую принадлежность содержащихся в них только мясных и растительных ингредиентов. Отсутствие стандартизованных методик измерений оценки видового состава молочной продукции выявило актуальность разработки методики идентификации сырьевого состава молока с применением метода ПЦР. Таблица 1. Стандартизованные методы ПЦР анализа Table 1. Standardized PCR methods № п/п Наименование стандарта Область распространения Определяемый параметр 1 ГОСТ Р 52173-2003. Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения Сырье и продукты пищевые Генетически модифицированные источники (ГМИ) растительного происхождения 2 ГОСТ 31719-2012. Продукты пищевые и корма. Экспресс-метод определения сырьевого состава (молекулярный) Корма, пищевые продукты, продовольственное сырье растительного, животного происхождения, в том числе подвергавшиеся термической обработке Видоспецифичный фрагмент ДНК животных и растений 216