Вестник МГТУ. 2018, №3.

Вестник МГТУ. 2018. Т. 21, № 3. С. 447–459. DOI: 10.21443/1560-9278-2018-21-3-447-459 449 Метод определения общего содержания фенольных веществ. Определение фенольных веществ основано на их способности связываться с белковыми веществами, осаждаться солями металлов, окисляться и давать цветные реакции. Исследования проводились по методу [19]. Колориметрический метод определения общего содержания фенольных веществ основан на применении реактива Фолина. Под реактивом Фолина подразумевают реактив Folin – Ciocalteu, который готовят из вольфрамата Na, молибдата Na, H 2 O, 85%-го H 3 PO 4 , HCl, сульфата Li и Br 2 . Реакцию Фолина и ее варианты применяют для обнаружения и фотометрического определения фенолов, тиолов и дисульфидов (цистина, цистеина), пуриновых оснований (гуанина, ксантина, 2-гидроксиаденина), мочевой кислоты, пептидов и белков, содержащих тирозин и триптофан. В присутствии перечисленных соединений в щелочной среде реактив Фолина восстанавливается при окислении фенолов до смеси синих оксидов WO 2 × nWO 3 или MoO 2 × nMoО 3 . Образующаяся голубая окраска пропорциональна количеству фенольных веществ. Интенсивность синей окраски измеряется на спектрофотометре при длине волны 725 нм. В стерильные пробирки к 0,25 мл готового экстракта шоколада или продуктов переработки какао- бобов концентрацией 0,1 мг/см 3 приливали 0,25 мл 50%-го водного раствора реактива Folin – Ciocalteu, 0,50 мл насыщенного раствора карбоната натрия и 4,00 мл дистиллированной воды. В контрольную пробу вместо экстракта приливали 0,25 мл дистиллированной воды. Смесь выдерживали 25 мин при 25 °С при постоянном помешивании для завершения реакции. Далее пробы центрифугировали 10 мин при скорости 2 000 об/мин. Содержание фенольных веществ в прозрачном растворе экстракта шоколада или продуктов переработки какао-бобов определяли спектрофотометрическим методом на спектрофотометре. Спектр поглощения снимали при длине волны 725 нм в кювете с толщиной слоя жидкости 10 мм. В кювету сравнения помещали контрольную пробу. Калькуляцию фенольных соединений в мг галловой кислоты (ГК)/100 г продукта проводили по калибровочной кривой. Метод определения общего содержания флавоноидов. Исследование содержания флавоноидов проводят по методу [20] с модификацией для шоколада или продуктов переработки какао-бобов. В пробирки помещали 0,50 мл экстракта концентрацией 0,1 мг/см 3 , 2,50 мл дистиллированной воды, 0,15 мл раствора 5%-го нитрита натрия. Выдерживали в течение 5 мин. Затем приливали 0,30 мл 10%-го хлорида алюминия (III), выдерживали в течение 5 мин. Добавляли 1,00 мл 1 М гидроксида натрия и 5,00 мл дистиллированной воды. Содержание флавоноидов определяли спектрофотометрическим методом. Спектр поглощения снимали при длине волны 510 нм в кювете с толщиной слоя жидкости 10 мм. В кювету сравнения помещали дистиллированную воду. Калькуляцию флавоноидов в мг катехина (К)/100 г продукта проводили по калибровочной кривой. DPPH метод (метод определения радикалудерживающей способности с использованием реактива 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила). Одним из способов оценки антиоксидантной активности является колориметрия свободных радикалов. Данный метод основан на реакции стабильного синтетического радикала DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилгидразила), растворенного в этаноле, с образцом антиоксиданта, содержащегося в экстракте [21]. В результате восстановления свободного радикала DPPH антиоксидантами шоколада или продуктов переработки какао-бобов пурпурно-синяя окраска DPPH меняется на желтую, так как происходит переход свободного радикала 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила, имеющего пурпурно- синюю окраску, в стабильную молекулу 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила, который имеет желтую окраску. Существует два способа проведения эксперимента по данному методу – статический и динамический. Статический показывает, при какой концентрации экстракта наблюдается наилучшее ингибирование свободных радикалов. Динамический способ характеризует процесс ингибирования во времени и показывает время, которое необходимо для ингибирования радикалов DPPH антиоксидантами экстракта с концентрацией, при которой наблюдается наилучшее ингибирование свободных радикалов. Также, чтобы охарактеризовать антиоксидантную активность, существует параметр Е С50 – это та концентрация экстракта, при которой происходит 50%-е ингибирование радикала DPPH антиоксидантом экстракта. Торможение реакций окислительного распада происходит тем быстрее и антиоксидантная активность образцов тем выше, чем ниже показатель Е С50 . В пробирки помещали 0,20 мл экстракта шоколада или продуктов переработки какао-бобов концентрацией 0,1 мг/см 3 , 2,00 мл дистиллированной воды, 2,00 мл спиртового раствора 2,2-дифенил-1- пикрилгидразила. В контрольную пробу по экстракту вместо раствора 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила помещали дистиллированную воду. В контрольную пробу по раствору 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила приливали вместо экстракта дистиллированную воду. Смесь выдерживали в течение 30 мин в недоступном для света месте. Колориметрию свободных радикалов 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила проводили спектрофотометрическим методом при длине волны 517 нм в кювете толщиной слоя жидкости 10 мм. В кювету сравнения помещали этиловый спирт. Для проведения этого исследования в качестве экстракта использовали экстракты с концентрацией 0,005, 0,05, 0,1, 0,25, 0,5 г/см 3 .