Вестник МГТУ. 2018, №3.

Вестник МГТУ. 2018. Т. 21, № 3. С. 402–411. DOI: 10.21443/1560-9278-2018-21-3-402-411 405 ионообменной хроматографии обнаружено два белковых пика, проявляющих активность трипсина, вероятно, соответствующих изоформам этого фермента, обладающих отрицательным зарядом (анионные формы). Молекулярная масса соответствующих пиков, определенная методом электрофореза, составила 26 и 28 кДа. Полученные данные аналогичны установленным ранее для других видов голотурий. Известно, что основным отличием сериновых протеаз трипсинового и химотрипсинового типов высших позвоночных от аналогов у беспозвоночных и рыб является наличие у последних множественных анионных форм. Это свойство определяет устойчивость сериновых протеаз к автолизу и быструю инактивацию в кислой среде [16]. При определении субстратной специфичности ферментов кишечника трепанга по отношению к различным белковым субстратам (табл. 1) установлено, что наиболее быстро протеолизу подвергаются гемоглобин и казеин. Это соответствует как структуре самих субстратов, так и возможностям большинства протеаз. Коллагенолитическая активность в кишечнике трепанга достаточно высока, так, например для пилорических придатков рыб подобная величина не превышает 1–1,5 % для нативного коллагена и 3–5 % для денатурированного [16]. Таблица 1. Субстратная специфичность протеолитических ферментов кишечника трепанга по отношению к различным белковым субстратам (рН 6,0) Table 1. Substrate specificity of proteolytic enzymes of trepang intestine in relation to various protein substrates (pH 6.0) Субстрат Остаточная активность, % Гемоглобин 100 Казеин 94,7 Протамин 30,2 Фибрин 9,9 Коллаген 1 типа 2,5 Денатурированный коллаген 6,7 Исследовано воздействие таких необратимых ингибиторов, как тозиллизил-хлорметилкетон (TЛХК) – необратимый ингибитор трипсина, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) – ингибитор металлопротеиназ, соевый ингибитор трипсина (СТИ) – белковый ингибитор широкого спектра, тормозящий активность многих сериновых протеиназ. При этом остаточная активность протеаз кишечника трепанга по отношению к контрольному образцу (без ингибиторов) составила 57, 69 и 74 % соответственно. Полученные результаты свидетельствуют о присутствии сериновых протеиназ, в частности, трипсинового типа и металлопротеиназ. Таким образом, экстракты внутренностей трепанга А. japonicas показали преобладание активных в низкотемпературных условиях кислых и нейтральных протеаз, нестабильных при высоких температурах. Субстратно-ингибиторный анализ позволяет с наибольшей вероятностью отнести их к группе цистеиновых металлопротеаз. Показано присутствие ферментов трипсинового типа при нулевой активности химотрипсина. Ферменты мышечной ткани. Для анализа протеолитической активности ферментов мускульного мешка голотурий был выбран тот же диапазон рН и использованы образцы, взятые в два периода – нагула и нереста (рис. 3). Рис. 3. рН зависимость протеолитической активности мышечной ткани трепанга: ▲ – период роста (май), ■ – период нереста (июль) Fig. 3. pH dependence of trepang muscle tissue proteolytic activity: ▲ – growth period (May), ■ – spawning period (July)