Вестник МГТУ. 2017, №2.

Вестник МГТУ. 2017. Т. 20, № 2. С. 308–315. DOI: 10.21443/1560-9278-2017-20-2-308-315 309 В течение ряда лет авторами были проведены экспериментальные исследования по подбору условий культивирования морских одноклеточных водорослей различных таксономических групп с последующим использованием их в качестве тест-объекта при изучении ответных реакций на загрязнение водной среды тяжелыми металлами. Материалы и методы В работе использовали культуры одноклеточных морских водорослей разных таксономических рангов из коллекции Морской станции (Station Marine d’Endoume, Marseille, France), выделенные из Марсельского залива Средиземного моря. Водоросли культивировали на специально подобранной среде, обеспечивающей оптимальный рост каждого вида в лабораторных условиях. При подборе среды для тестирования исходили из условий максимального приближения ее состава к природной воде, минимизируя при этом комбинацию и концентрации химических соединений, вносимых в морскую воду, предварительно отфильтрованную через мембранный фильтр 0,22 µк. Опыты проводили в стеклянных колбах емкостью 250 мл со 100 мл культуры водорослей при температуре 18–20 °С с заранее установленной исходной численностью клеток, обеспечивающей оптимальный рост каждого вида водорослей. Выбранные начальные численности водорослей обеспечивали хорошую сходимость измеряемых параметров при тестировании, включая определение фотосинтетических пигментов. Водоросли культивировали при освещенности 1,5 µВт/cм² при фотопериоде 14 : 10 (свет : темнота). Численность клеток водорослей определяли в счетной камере Нажотта объемом 1/20 мл, просчитывая не менее 1500 клеток в каждой пробе. Биомассу водорослей определяли расчетным методом геометрического подобия, измеряя линейные размеры клеток и рассчитывая их объем, принимая 1 мкм³ равным 1 пг [5]. Концентрацию пигментов в клетках определяли спектрографическим методом. Пробы фильтровали через мембранные фильтры GC-50, предварительно пропустив сквозь него 5 мл суспензии углекислого магния для предотвращения деградации хлорофилла "а". Пигменты экстрагировали 90%-м водным раствором ацетона при 4 °С в условиях затемнения после разрушения клеток в стеклянном гомогенизаторе. Содержание феофитина "а" определяли по изменению оптической плотности вытяжки пигментов при 430, 665 и 750 нм, добавляя в кювету 0,1 мл 0,1 N HCl непосредственно после того, как в пробе была измерена концентрация хлорофилла "а" [6]. Соли тяжелых металлов (ртути, кадмия, меди, свинца) во избежание преципитации фосфатов и солей железа стерилизовали методом фильтрации и вносили после стандартной стерилизации основной среды в начале фазы экспоненциального роста культуры водорослей. Скрининг токсичности тяжелых металлов для водорослей проводили в концентрациях 1–2 000 мкгМе/л (с интервалом 2,5 мкг/л – от 5 до 25 мкг/л, с интервалом 25 мкг/л – от 25 до 100 мкг/л, с интервалом 100 мкг/л – от 100 до 500 мкг/л, с интервалом 250 мкг/л – от 1000 до 2000 мкг/л). Результаты и обсуждение В предварительных опытах был подобран оптимальный вариант питательной среды, на которой хорошо росли морские водоросли разных таксонов: диатомовые, ксантофициевые, криптофициевые, хризофициевые и одноклеточные красные водоросли. Была установлена также начальная плотность в интервале (5–30) × 10³ кл/мл для разных по объему клеток водорослей. При такой стартовой плотности культуры водорослей деление клеток происходило через регулярные интервалы и составляло 1,5–1,6 делений в сутки. При увеличении начальной плотности культуры происходил резкий рост численности, повышалось содержание деривата хлорофилла "а" – феофитина в составе фотосинтетических пигментов, а также возрастало число деградированных клеток и выделение в среду вторичных метаболитов. Последнее оказалось нежелательным при тестировании токсичности тяжелых металлов, поскольку могло привести к искажению получаемых данных в результате связывания металлов в комплексы. В итоге были найдены оптимальные условия для морских одноклеточных водорослей, выделенных из планктонного сообщества и выращиваемых в лаборатории в условиях аксеничных культур на обогащенной биогенными элементами унифицированной среде, включая начальную плотность, освещенность, фотопериод и температуру культивирования (табл. 1). Эксперименты с тяжелыми металлами выявили различную устойчивость водорослей к определенному металлу, не только относящихся к разным отделам, но и к видам одной и той же таксономической группы. Причем устойчивость водоросли к действию одного из тяжелых металлов, как было установлено, не предопределяет толерантность к другим испытанным металлам. Так, среди пяти видов диатомовых, наиболее массово представленных в морском планктоне, токсическое действие испытанных металлов различалось иногда на два порядка. Наиболее токсичной для водорослей оказалась ртуть, которая в концентрациях 5–10 мкг/л ингибировала рост культуры, который выражался в удлинении лаг-фазы роста, снижении содержания хлорофилла и скорости деления клеток. Высокая чувствительность к воздействию кадмия, как оказалось, свойственна диатомовой водоросли Cylindrotheca clostertium , а к соли меди другой