Вестник МГТУ. 2015, №1.

ВестникМГТУ, том 18, № 1, 2015 г. стр. 100-109 среды, количественного соотношения ферментного препарата и гидролизуемого сырья, продолжительности протеолиза. Глубина ферментативной реакции незначительно зависит от типа используемого субстрата (сырья) и определяется главным образом природой фермента (Неклюдов и др., 2000). Показано, что из всех исследованных ферментов ферментный препарат гепатопанкреатин, полученный из гепатопанкреаса (пищеварительной железы) камчатского краба Paralithodes camtschaticus, проявляет высокую субстратную специфичность по отношению к белкам морских организмов, в том числе рыб (Dynamic light scattering..., 1985; Vorob ’ev, Goncharova, 1998). Сложность построения физико-химической модели ферментативного протеолиза связана со спецификой процесса, в котором и субстрат и катализатор (фермент) являются биополимерами, обладающими определенными пространственными конформациями. С химической точки зрения интерес представляют прежде всего кинетические закономерности ферментативного гидролиза макромолекул белка и полипептидных цепей, определяемые как фермент-субстратным связыванием, так и межцепочечными взаимодействиями, экранирующими доступ фермента к пептидным связям. Существенное влияние на кинетику оказывает и явление автолиза - гидролиз белковых макромолекул самого фермента (Mukhin, Novikov, 2001). В настоящее время предпринимаются попытки компьютерного моделирования многостадийного процесса протеолиза на примере модельных глобулярных белков (Westermeier, 1993), при этом установление детального механизма ферментативного гидролиза белоксодержащих веществ остается нерешенной проблемой. Целью работы являлось изучение кинетических закономерностей ферментативного гидролиза белоксодержащих субстратов (тканей атлантической трески) на примере протеолитических реакций с использованием ферментного препарата - гепатопанкреатина, а также эффектов, возникающих при различных способах введения ферментного препарата в реакционную среду. 2. Материалы и методы 2.1. Материалы В качестве белоксодержащего сырья для получения белкового гидролизата методом ферментативного гидролиза использовали отходы переработки атлантической трески (головы, плавники, кости, мышечная ткань). Ферментный препарат протеолитического действия - гепатопанкреатин - получен из гепатопанкреаса (пищеварительной железы) камчатского краба Paralithodes camtschaticus в лаборатории биохимии и технологии Полярного научно-исследовательского института морского рыбного хозяйства и океанографии имени Н.М. Книповича (ПИНРО) (Mukhin, Novikov, 2001; 2002). Протеолитическая активность препарата составляет 1.62 ед./мг (по отношению к 1%-му гемоглобину, pH 3.5). Гепатопанкреатин проявляет наибольшую активность в интервалах температур 50-55 °C и значений pH 7-9 инкубационной среды и обладает широкой субстратной специфичностью. Химический и аминокислотный состав белоксодержащего сырья (отходов переработки трески) и ферментного препарата (гепатопанкреатина) приведены в табл. 1-3. 2.2. Получение гидролизата Белоксодержащее сырье гомогенезировали (измельчали) до получения однородной массы. К сырью добавлялась дистиллированная вода в массовом соотношении 1:1. Смесь нагревалась до 50 °C и устанавливалась pH 7.5 для создания оптимальных условий гидролиза, обеспечивающих максимальную активность ферментного препарата. Ферментный препарат - гепатопанкреатин - вводили в реакционную смесь двумя способами. В первом случае гепатопанкреатин добавляли один раз в количестве 6 г/(кг сырья), во втором - ферментный препарат добавляли многократно через каждые 30 мин в процессе гидролиза по 6 г/(кг сырья). Реакцию гидролиза проводили при непрерывном перемешивании в течение 6 ч, по истечении которых реакционную смесь нагревали до 100 °C в течение 20 мин для инактивации ферментного препарата. После охлаждения гидролизат очищали от липидов и нерастворимых белковых фракций сепарированием. Для осаждения примесей в гидролизат вводили необходимый объем 1%-го раствора хитозана (в 0.1М НС1), устанавливали нейтральное значение pH 7.2±0.2, добавляя 18%-й раствор НС1, центрифугировали для удаления осадка. После фильтрования с использованием бумажных фильтров гидролизат сушили в лиофильной сушилке (сублимационная сушка) при -40 °C под вакуумом. Таблица 1. Содержание микроэлементов в белоксодержащем сырье Микроэлемент Ni Мп Си Со Сг Fe Zn Cd Содержание, мкг/(г сухого вещества) 5.00 4.22 2.25 1.77 1.74 0.07 0.04 0.01 101